流式細(xì)胞儀驗(yàn)證

1．流式細(xì)胞儀介紹

流式細(xì)胞儀(Flowcytometry)是對(duì)于處在快速直線流動(dòng)狀態(tài)中的細(xì)胞或生物顆粒同時(shí)利用檢測(cè)器進(jìn)行多參數(shù)、快速的自動(dòng)分析和分選的裝置。它可以快速測(cè)量、存貯、顯示懸浮在液體中的分散細(xì)胞的一系列重要的生物物理、生物化學(xué)方面的特征參量，并可以根據(jù)預(yù)選的參量范圍的細(xì)胞亞群從中分選出來(lái)。 但流式細(xì)胞儀的細(xì)節(jié)分辨率為零，即它只能測(cè)量一種細(xì)胞的總核酸量，總蛋白量等指標(biāo)，而不能鑒別和測(cè)出某一特定部位的核酸或蛋白的具體數(shù)目。流式細(xì)胞儀主要由液流系統(tǒng)、光學(xué)系統(tǒng)、檢測(cè)系統(tǒng)、分析系統(tǒng)四部分組成。目前已廣泛應(yīng)用于細(xì)胞生物學(xué)、免疫學(xué)、臨床醫(yī)學(xué)、基礎(chǔ)科學(xué)研究、細(xì)胞遺傳學(xué)、生物化學(xué)等研究的各個(gè)領(lǐng)域。

2.流式細(xì)胞儀的原理

流式細(xì)胞儀的工作原理為：將經(jīng)特異性熒光染料染色后的待測(cè)細(xì)胞放入樣品管中，細(xì)胞在氣體的壓力下進(jìn)入充滿(mǎn)鞘液的流動(dòng)室，然后鞘液和樣品流在噴嘴附近組成一個(gè)圓柱流束，與水平方向的激光束垂直相交，染色的細(xì)胞受激光照射后發(fā)出熒光或產(chǎn)生散射光，這些信號(hào)分別被光電倍增管熒光檢測(cè)器和光電二極管散射光檢測(cè)器接收，轉(zhuǎn)變?yōu)殡娦盘?hào)后，經(jīng)過(guò)計(jì)算機(jī)儲(chǔ)存、計(jì)算、分析這些數(shù)字化信息，就可得到細(xì)胞的大小、活性、核酸含量、酶和抗原的性質(zhì)等物理和生化指標(biāo)。

3．相關(guān)術(shù)語(yǔ)

設(shè)門(mén)：劃定某一區(qū)域的細(xì)胞群體，對(duì)其單獨(dú)加以分析或分選。

調(diào)補(bǔ)償：若兩種以上的熒光素的發(fā)射光譜之間存在重疊，則需要調(diào)補(bǔ)償。

MFI值：即為平均熒光強(qiáng)度。

4．為什么流式細(xì)胞儀要做驗(yàn)證呢？

流式細(xì)胞儀是對(duì)細(xì)胞或生物顆粒物理、化學(xué)等相關(guān)參數(shù)的自動(dòng)分析和分選的裝置，對(duì)流式細(xì)胞儀進(jìn)行驗(yàn)證就是保證分析檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確、可靠，所以必須對(duì)所用到的組成系統(tǒng)各部分進(jìn)行驗(yàn)證，以證明該系統(tǒng)符合檢測(cè)的目的和要求，這就是儀器驗(yàn)證。本質(zhì)上講，儀器驗(yàn)證就是根據(jù)檢測(cè)物質(zhì)的要求，預(yù)先對(duì)儀器設(shè)置一定的參數(shù)范圍及合適的檢測(cè)器，并通過(guò)設(shè)計(jì)合理的試驗(yàn)來(lái)驗(yàn)證該儀器是否符合檢測(cè)項(xiàng)目的要求。這些驗(yàn)證項(xiàng)目如分辨力、線性相關(guān)系數(shù)、重復(fù)性、示值誤差等某一個(gè)產(chǎn)生誤差，其他的都會(huì)有一定的偏移，致使結(jié)果改變。儀器驗(yàn)證就是保證整個(gè)試驗(yàn)是否能成功的先決條件，只有經(jīng)過(guò)驗(yàn)證的儀器，確保該儀器各部分都在良好的情況下才能用于細(xì)胞相關(guān)參數(shù)的分析、分選，使檢測(cè)結(jié)果得到保證，使誤差降低到最小。

5．流式細(xì)胞儀驗(yàn)證項(xiàng)目

（1）安裝確認(rèn)

a.文件確認(rèn)

b.附件確認(rèn)

c.安裝環(huán)境確認(rèn)

d.安裝情況確認(rèn)

（2）行功能確認(rèn)

a.行功能確認(rèn)

b.軟件控制功能測(cè)試

（3)性能確認(rèn)

a.辨力測(cè)試

b.線性相關(guān)系數(shù)測(cè)試

c.檢出限測(cè)試

d.漂移測(cè)試

e.重復(fù)性測(cè)試

f.示值誤差測(cè)試

6.流式細(xì)胞儀的操作步驟

(1)檢測(cè)鞘液桶和廢液桶的狀態(tài)是否滿(mǎn)足本次使用，蓋緊黑蓋；

(2)檢測(cè)穩(wěn)壓電源，打開(kāi)電源，對(duì)系統(tǒng)進(jìn)行預(yù)熱5-10分鐘；

(3)打開(kāi)氣體閾，調(diào)節(jié)壓力，獲得適宜的液流速度，應(yīng)排除管路中氣泡；開(kāi)啟光源冷卻系統(tǒng)；

(4)在樣品管中加入去離子水，沖洗液流的噴嘴系統(tǒng)；

(5)利用校準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)樣品，調(diào)整儀器，使在激光功率、光電倍增管電壓、放大器電路增益調(diào)定的基礎(chǔ)上，0和90散射的熒光強(qiáng)度*，并要求變異系數(shù)為最??；

(6)選定流速、測(cè)量細(xì)胞數(shù)、測(cè)量參數(shù)等，在同樣的工作條件下測(cè)量樣品和對(duì)照樣品；同時(shí)選擇計(jì)算機(jī)屏上數(shù)據(jù)的顯示方式，從而能直觀掌握測(cè)量進(jìn)程；

(7)樣品測(cè)量完畢后，再用去離子水沖洗液流系統(tǒng)；

(8)因?yàn)閷?shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)已存入計(jì)算機(jī)硬盤(pán)（有的機(jī)器還備有光盤(pán)系統(tǒng)，存貯量更大），因此可關(guān)閉氣體、測(cè)量裝置，而單獨(dú)使用計(jì)算機(jī)進(jìn)行數(shù)據(jù)處理；

(9)最后將所需結(jié)果打印出來(lái)，操作完畢，關(guān)機(jī)。

7.注意事項(xiàng)

a.光電倍增管要求穩(wěn)定的工作條件，所有需放置在避光的環(huán)境下；另外還要注意磁屏蔽；

b.光源不得在短時(shí)間內(nèi)（一般要1h左右）關(guān)上又打開(kāi)；使用光源必須預(yù)熱并注意冷卻系統(tǒng)工作是否正常；

c.液流系統(tǒng)必需隨時(shí)保持液流暢通，避免氣泡堵塞；

d.鞘流液使用前要經(jīng)過(guò)過(guò)濾、消毒，必須符合使用要求；

e.不同的檢測(cè)對(duì)象選用對(duì)應(yīng)的濾片系統(tǒng)、放大器的類(lèi)型等；

f.特別注意的是每次檢測(cè)都需要空白對(duì)照組，做對(duì)照試驗(yàn)；

g.調(diào)節(jié)電壓時(shí)，如果檢測(cè)的目標(biāo)細(xì)胞體積較小，可以適當(dāng)提高電壓值。

公司背景介紹：

澤恒.華譜在計(jì)量校準(zhǔn)、驗(yàn)證與確認(rèn)的優(yōu)勢(shì)是專(zhuān)注做生物制藥質(zhì)控服務(wù)，針對(duì)一些特殊的儀器都非常熟悉，核心團(tuán)隊(duì)來(lái)源于制藥公司和儀器廠家，對(duì)儀器和GMP法規(guī)都很熟悉，比如：我們團(tuán)隊(duì)專(zhuān)門(mén)研發(fā)了替代進(jìn)口的熒光定量PCR儀校準(zhǔn)裝置，大大降低熒光定量/定性PCR儀校準(zhǔn)的成本（遠(yuǎn)低于同行）；我們開(kāi)發(fā)了細(xì)胞計(jì)數(shù)儀的校準(zhǔn)內(nèi)部規(guī)程；開(kāi)發(fā)了細(xì)胞復(fù)蘇儀的內(nèi)部校準(zhǔn)規(guī)程；開(kāi)發(fā)了凝膠電泳掃描儀的校準(zhǔn)規(guī)程；我們開(kāi)發(fā)了溫度驗(yàn)證所需要的超低溫和超高溫一體化無(wú)線探頭，降低用戶(hù)大量使用探頭時(shí)的成本，代替了進(jìn)口；這些例子還有很多，因?yàn)槲覀兌际巧锍錾?，所以我們關(guān)注每一個(gè)生物用戶(hù)工藝要求，在生物制藥儀器設(shè)備上面專(zhuān)注，“與質(zhì)量同行、做儀器設(shè)備質(zhì)控"，為了讓生物制藥更安全而努力。

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